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研究人员发现胞嘧啶碱基编辑器会产生大量的靶外效应

来自美国、中国和德国的研究人员报告了他们开发的一种新方法,该方法可以检测使用CRISPR-Cas9或两种基本编辑技术之一编辑小鼠胚胎的一个胚粒时产生的靶外突变。

这种名为GOTI(双细胞胚胎注射的全基因组靶外分析)的方法,通过CRISPR-Cas9或腺嘌呤碱基编辑器7.10(ABE7.10)编辑的胚胎中,靶外单核苷酸变异(SNV)非常罕见,这两种方法都会引起靶外效应,频率接近自发突变率。然而,研究人员还发现,胞嘧啶碱基编辑3(BE3)诱导SNV的频率比自发突变率高20倍以上。

研究小组首先将CRISPR-Cas9、BE3或ABE7.10以及Cre mRNA注射到一个胚泡中,胚泡由表达tdTomato荧光蛋白的小鼠胚胎发育而来。然后在胚胎第14.5天,根据基因编辑细胞中tdTomato的表达对编辑和未编辑的卵裂球的后代细胞进行分类,并且研究人员分别对tdTomato阳性和tdTomato阴性细胞进行全基因组测序。在tdTomato阳性样本中,使用来自同一胚胎的tdTomato阴性样本作为参考,通过三种算法调用SNVS和INDELS。

“在Cre或Cas9处理过的样品中检测到的SNV很可能是由发育过程中基因组复制期间的自发突变引起的,因为变异的数量在模拟自发突变的范围内,并且在识别的SNV的相邻序列和目标位点之间没有观察到序列相似性。”作者写道。“令人惊讶的是,我们发现BE3处理的胚胎中平均有283个SNV/胚胎,这个水平至少比Cre或Cas9处理的胚胎高出20倍。相比之下,ABE7.10平均产生10个SNV/胚胎,频率接近自发突变率。”

研究人员进一步发现,BE3诱导的SNV在转录区域明显富集,特别是在高表达基因中,并且没有一个靶外位点被任何BE3处理的胚胎共享,或者与预测的靶外突变重叠。

“此外,在靶外和靶外序列之间没有观察到相似性,”他们补充道,“而顶端预测的靶外位点与Be3靶上位点显示出高度的序列相似性。因此,BE3脱靶SNVs与sgRNA无关,可能是由APOBEC1的过度表达引起的。”

研究小组还注意到,在这项分析中出现了许多由BE3诱导的从头开始的SNV,这在以前的研究中没有报道过。研究人员推测,这可能是因为GOTI检查了来自单个基因编辑的卵裂球的细胞群体,而先前的研究使用了大量的细胞池,其中编辑是可变的,导致随机偏离效应的信号丢失。他们的结论是,通过降低APOBEC1的DNA结合能力或使用不同版本的胞苷脱氨酶,可以减少碱基编辑的靶外效应,并且GOTI可以用于检查各种基因编辑工具的靶外效应。

在另一项研究中,来自韩国的研究人员表示,Cas9、BE3和ABE7.10通常可以识别不同的脱靶位点。他们还使用了一种靶向测序方法以及预先组装的腺嘌呤碱基编辑器核糖核蛋白、修饰的引导RNA和Sniper/Cas9,以减少人类细胞中腺嘌呤碱基编辑器的靶外活动。

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在之前的一项研究中,这些研究人员使用了一种改进的双基因组测序协议来检测人类基因组中胞嘧啶碱基编辑器的脱靶效应。在这项研究中,他们试图使用相同的协议来分析腺嘌呤碱基编辑器的靶外效应。

他们首先通过测试一系列针对内源性基因组位点的不匹配sgRNA来分析ABE7.10、BE3和CRISPR-Cas9的靶外活动是否彼此不同,并发现碱基编辑器和Cas9核酸酶可以容忍sgRNA中的大多数单或双不匹配,但当与大多数具有三重或四重不匹配的sgRNA组合时活性较差。

他们还注意到Cas9,ABE7.10和BE3对不匹配sgRNA的耐受性通常彼此不同,这表明ABE7.10,Be3和Cas9可以识别人类基因组中不同的非靶位点集合。研究人员得出结论,需要一种方法以无偏见的方式确定腺嘌呤碱基编辑器的全基因组特异性。

在各种分析表明Digenome-seq可用于全面绘制腺嘌呤碱基编辑的全基因组靶上和靶外位点后,研究人员继续确定了人类基因组中的abab7.10个靶外位点。他们给整个基因组的每个碱基对位置分配了一个DNA切割分数,允许对腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器与Cas9进行直接比较,并发现腺嘌呤碱基编辑器一般比Cas9更特异,但可以识别不同的离靶位点集合。

他们还意外地发现ABE7.10活性与Cas9活性的相关性比与BE3活性的相关性更强。在ab7.10频率相对较高但BE3频率较低的6个位点中,有2个位点在几个核苷酸的BE3编辑窗口中没有胞嘧啶。

在随后的一项实验中,为了最小化或避免腺嘌呤碱基编辑的脱靶效应,研究人员测试了三种不同的方法,这些方法已经证明可以减少Cas9和BE3编辑的脱靶效应:sgRNA修饰、用RNPs取代质粒,以及使用工程Cas9变体Sniper-Cas9。他们发现,在不牺牲目标活性的情况下,扩展的sgRNAs降低了几乎每个位点的离靶点活性,而截断的sgRNAs降低了大多数位点的离靶点活性和离靶点活性,并加剧了在5'端或临近端存在不匹配的位点的离靶点效应。

此外,使用Sniper ABE7.10或交付ABE7.10 RNPs而不是质粒提高了碱基编辑的特异性,并且将Sniper ABE7.10与修饰的sgRNA结合进一步降低了许多经验证的靶外位点的靶外活性。